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竹島 浩

Ｓ中間－1
平成１７年度科学研究費補助金（基盤研究（Ｓ））研究状況報告書
ふりがな（ローマ字）
TAKESHIMA HIROSHI
①研究代表者
氏 名
竹島 浩
②所属研究機関・
部局・職
東北大学・大学院医学系研究科・教
授
和文 カルシウムストアの分子構築に関する研究
③研
究
課
題
名
英文 A study on the molecular basis of intracellular Ca2+ stores
平成15年度 平成16年度 平成17年度 平成18年度 平成19年度
総 合 計
④研究経費
17 年度以降は内約額
金額単位：千円
36,200 12,800 12,800 12,800 12,800 87,400
⑤研究組織
（研究代表者及び研究分担者）
氏 名
所属研究機関・部局・職 現在の専門
役割分担
（研究実施計画に対する分担事項）
竹島 浩
久米 秀明
東北大学・大学院医学系研
究科・教授
東北大学・大学院医学系研
究科・助手
生化学
生化学
研究の立案と統括、変異マウスの作製と解析
実験の遂行
タンパク化学実験の遂行
⑥当初の研究目的
（交付申請書に記載した研究目的を簡潔に記入してください。）
細胞質の Ca2+濃度の上昇は生理的反応のスイッチとなっており、その制御は神経伝達物質や
ホルモンの放出、筋細胞の収縮、細胞増殖や細胞死など多彩な細胞機能に及んでいる。興奮性細
胞における生理反応では、例外なく電気的シグナルが細胞内Ca2+シグナルへ変換され、通常の
場合には表層膜上の電位依存性 Ca2+チャネルと細胞内ストア膜上の放出Ca2+チャネル (リアノ
ジン受容体) の機能共役による活性化が普遍的に 観察される。我々のグループでは、興奮性細胞
の脱分極 -細胞内Ca2+シグナル変換、小胞体Ca2+放出機構やCa2+ストアとしての機能を包括的
に理解するため、それらの分子的基盤を整備することを目的とした研究を遂行している。近年の
代表的な成果としては、リアノジン受容体サブタイプの生理機能を明らかにしたことに加え、細
胞膜と小胞体を架橋するタンパク質であるジャンクトフィリンの分子同定と生理機能の解明な
どがある。これらの成果に立脚して本基盤研究 (S) においては、 (i) 興奮性細胞におけるリアノジ
ン受容体の活性調節の分子機構の解明と、 (ii) ジャンクトフィリンの中枢神経系における生理機
能の解明、 (iii)Ca2+ストア機能に関与する小胞体のタンパク質の新規同定とその機能解析を目的
とした研究を遂行している。細胞内Ca2+シグナルや小胞体Ca2+ストア機能の異常は様々な病態
を引き起こすと考えられており、リ
アノジン受容体やジャンクトフィリンの遺伝子変異は心臓疾
患や神経疾患などヒト遺伝病の原因 であることも解明されている。本研究にて、単に興奮性細胞
の Ca2+シグナリングの分子基盤に関する基礎生物学的貢献にとどまらず、病態解明や新たな創
薬標的の同定に向けた医学・薬学領域の応用研究への貢献となる成果も期待される。


Ｓ中間－2
⑦これまでの研究経過
（研究の進捗状況について、必要に応じて図表等を用いながら、具体的に記入してください。）
上記の研究目的に則して以下の研究を平成 15-16 年度に遂行した。
(i) リアノジン受容体の活性調節の分子機構の解明 ：骨格筋細胞では１型リ
アノジン受容体(RyR1) は三つ組構造
(細胞表層膜と小胞体膜が近接した結合膜構造) に局在しており、収縮反応を引き起こすCa2+放出を担当して
いる。一方、我々が数年前に見い出したミツグミン 29(MG29) と命名した分子は三つ組構造の細胞表層膜側に
局在する膜タンパク質である。MG
29 欠損マウスの骨格筋では興奮収縮連関の効率低下が観察されており、
RyRの機能低下が推定されていた。培養細胞系におけるRyR1 とMG29 の共発現は、RyR1 の持続的活性化
による小胞体 Ca2+含量の低下のため、細胞死を引き起こすことを見い出した。RyR1
の単独発現ではそのよ
うな現象は観察されず、人工脂質二重膜でのRyR1 チャネルはMG29 添加により活性化される。これらの結
果は、骨格筋におけるMG29 によるRyR1 活性化を示唆する(文献 10) 。一方、骨格筋では大量に存在する
RyR1
に加えて、少量の３型受容体(Ry
R3) も共存している。RyR1 欠損では興奮収縮連関が欠失し致死性を伴うのに
対し、RyR3 欠損では骨格筋の顕著な収縮異常は 認められない。しかしながら、RyR3 欠損筋においては浸透
圧変化に対応して発生する
Ca2+スパーク(RyRチャネルのクラスターが局部的なCa2+放出をする現象を共焦
点顕微鏡でとらえたもの) の頻度が顕著に上昇していることが最近明らかになった。従って、骨格筋において
は、RyR3 共存によりRyR1 の活性が抑制されていることが推定される (論文投稿中) 。
(ii) ジャンクトフィリンの生理機能の解 明：以前の研究において、３種のジャンクトフィリンサブタイプ
(JP1,JP2,JP3) の存在が明らかになっており、中枢系ではJP3 が特異的に発現していることが観察されていた。
しかしながら、JP1 とJP2 の欠損マウスは致死性を示すのに対 して、JP3 欠損マウスでは顕著な異常は観察
されない。このノックアウトマウスの結果から新たなJPサブタイプの存在を予想して、中枢系に特異的に発
現するJP4 を見い出した。分布解析からはJP3 とJP4 は神経細胞特異的に極めて類似した発現パターンを呈
しており、それらのmRNAは細胞体のみならず樹状突起での分布も観察された。この事実はJP3 とJP4 の
mRNAsが樹状突起方向へ選択的に輸送される機構が存在することを示唆してお り、電子顕微鏡にて細胞体と
樹状突起にて結合膜構造が観察されることの原因となっている可能性が高いと考察された(
文献６) 。現在、JP4
欠損マウスとJP3,JP4 同時欠損 マウスの作製に成功し、離乳時期に致死性を示すJP3,JP4 同時欠損マウスの
解析を進めており、下肢反射の異常、運動協調性の低下など興味深い表現型が明らかになりつつある (未発表
データ) 。JP3 遺伝子変 異はハンチントン舞踏病と類似のヒト遺伝子疾患(HDL2) を引き起こすことも知られて
おり、これらモデルマウスを用いて中枢系でのJP生理機能の解明に迫まるため現在精力的に解析を遂行して
いる。一方、骨格筋における
JP1 とJP2の共発現と三 つ組形成の関連を明らかにするため 、本来JP2 のみを
発現する心筋細胞でJP1 を人工的に発現されるTGマウスの作製も遂行した (文献３) 。単に両者の共発現のみ
では心筋細胞内で三つ組構造 は観察されず、三
つ組構築には骨格筋特異的な細胞機能が必須であると考えられ
た。病態心筋モデルマウスにて
JP2 発現を検討した結果mRNAとタンパク質レベルともに低下していること
が明らかになり、心筋症や心不
全では細胞表層膜の電位依存性
Ca2+チャネルとリアノジン受容体の機能的共
役が低下していることが示唆された (文献１３) 。さらに、siRNAのマウス骨格筋への適用による
JP knockdown
実験も行い、結合膜構造は骨格筋興奮収縮連関のCa2+シグナルに加えて、ストア容量依存性Ca2+流入にも
重要であることが示されている(
論文投稿中) 。
(iii)小胞体のタンパク質の新規同定と機能解析：我々は骨格筋膜タンパク質に対する単クローン抗体の作製と
蛍光抗体染色による観察を組み合わ せることにより、新規小胞体分子の
検索を遂行している。その検索の中
か
ら、MG33 とMG53とを最近見い出している。解明された一次構造からMG33 は膜貫通セグメントを複数有
した筋小胞体膜内在性分子であり、架橋剤による実験ではMG33 はホモオリゴマーとして存在することが示
唆された。この実験事実から大胆ではあるがMG33 が小胞体上でチャネルとして機能している可能性を考慮
し、その検証を模索する実験を遂行中である。一方、骨格筋と心筋細胞に特異的なMG53 は膜貫通や脂質修
飾に関するアミノ酸配列がないもの の、各種の検討にて細胞表層膜また
はその直下に存在する細胞内小胞に分
布する分子と結論される。MG53 欠損マウスでは心電図測定により心 臓機能異常が認められ、電気生理学
解析
で心筋細胞での K+電流の低下が明らかになっている。特殊条件ではあるがMG53 がユビキチンE3 リガーゼ
として機能する可能性を示唆する結 果も得られ、変異マウスの機能異常とMG53 の分子機能の関連を現在検
討している。さらに、心筋と骨格筋の小胞体内腔タンパク質であるサルカルメニン(SAR) の生理機能の解明の
ため、SAR欠損マウスの作製と解析を遂行した。SARは筋小胞体のCa2+緩衝能に貢献するとともに、Ca2+
ポンプの安定性にも寄与しているこ とが明らかになった。その欠
損マウスにおいては、心エコーや心
カテーテ
ルにより心機能の低下や、張力測定において骨格筋の弛緩期延長が観察された(文献 16) 。一方、SAR骨格筋
に持続的な電気刺激を与えて検討を したところ、収縮疲労に対して野生
型と比較して高い抵抗性を示した。こ
の事実は収縮疲労と小胞体
Ca2+含量を関連付けるものとして注目される(論文投稿中) 。


Ｓ中間－3
⑧特記事項
（これまでの研究において得られた、独創性・新規性を格段に発展させる結果あるいは可能性、新たな知見、学問的・学術的なインパク
ト等特記すべき事項があれば記入してください。）
本研究は特定の小胞体膜タンパク質 に着目し、遺伝子欠損マウスの解析や遺伝子機能発現実験から生物
現象へアクセスする典型的なボトム アップ型の研究手法を用いている。研究経過の欄にて解説したジャン
クトフィリン、ミツグミン２９、ミツグミン３３、ミツグミン５３等は我々が分子同定した分子群であり、
現在までそれらを題材にした発表論文は当教室またはその共同研究教室以外からは見当たらない。従っ
て、遂行中の研究課題は極めて独自性の高いものと考えられる。国内外からのリクエストに応じてジャン
クトフィリンに関する実験材料 (変異マウス、抗体、cDNA等) については配布を行っているので、今後予
想を上回る研究成果が現れることも考えられる。
研究代表者は本研究課題と密接に関連した研究を約１５年間継続してお り、手掛けてきた研究成果が国
外の筋細胞 Ca2+シグナル研究領域の研究者に認識され始めたように感じている。特に同世代の研究者は
かつてリアノジン受容体の分子生物学的研究においてはライバル関係で あったが、現在では研究課題も独
自の路線に進んでおり、お互いのバックグラウンドを共有する良き理解者となっている仲間も多い。その
研究仲間の中で、２名の研究者が研究の遂行のため来日滞在し、現在順調にその共同研究が進展している。
平成１５、１６年度には延べ４ヶ月以上の期間、Prof. Zorzato(スイス・バーゼル大学病院) がJP-45と命
名された新規小胞体膜タンパク質のノックアウトマウスの作製実験やタンパク化学実験を遂行した。
JP-45 は骨格筋三つ組構造に特異的に発現する分子であり、Ca2+チャネルやCa2+結合タンパク質との相
互作用が試験管内検討にて確認され ているが、生理的機能はまったく不明である。最近germ-line
transmission が確認され、近日中に作製されるJP-45 欠損マウスの表現型が期待されている。平成１６
年度には以前より共同研究を行っているProf. Ma(米国・Robertwood Johnson Medical School) がジャン
クトフィリンに関する共同研究のた めに来日した。本研究課題における標的組織は興奮性細胞全般であり
多岐に渡っているが、小胞体膜タンパク質の分子同定に関しては材料調達の側面から骨格筋を用いてい
る。自然に骨格筋小胞体または密接に関連する心筋小胞体が研究課題となるケースが多いのであるが、残
念ながらこの研究分野での我が国の 研究者人口は近年減少傾向にある。今後は国外共同研究グループとの
若手研究者の相互派遣を活性化し、優れた成果を得られるようさらに尽力したい。


Ｓ中間－4-1
⑨研究成果の発表状況
（この研究費による成果の発表に限り、学術誌等に発表した論文（掲載が確定しているものを含む。）の全
著者名、論文名、学協会誌名、巻（号）、最初と最後のページ､発表年（西暦）、及び国際会議、学会等に
おける発表状況について記入してください。なお、代表的な論文 3件に○を、また研究代表者に下線
を付し
てください。）
英文原著論文：
1. Houtani, T., Ikeda, M., Kase, M., Sato, K., Sakuma, S., Kakimoto, S., Ueyama, T., Munemoto, Y.,
Takeshima, H. & Sugimoto, T. A subset of nociceptin/orphanin FQ receptor-expressing neurons in
the anterior hypothalamic area, as revealed in mice with lacZ reporter gene. Neurosci. Lett. 335,
217-219, 2003.
2. Inoue, M., Kawashima, T., Takeshima, H., Calo, G., Inoue, A., Nakata, Y. & Ueda, H. In vivo
pain-inhibitory role of nociceptin/orphanin FQ in spinal cord. J. Pharmacol. Exp. Ther. 305, 495-501,
2003.
3. Komazaki, S., Nishi, M. & Takeshima, H. Abnormal junctional membrane structures in cardiac
myocytes expressing ectopic junctophilin type 1. FEBS Lett. 542, 69-73, 2003.
4. Deper, U., Reinscheid, R. K., Takeshima, H., Brune, K. & Zeilhofer, H. U. Normal sensitivity
acute pain, but increased inflammatory hyperalgesia in mice lacking the nociceptin precursor
polypeptide or the nociceptin receptor. Eur. J. Neurosci. 17, 2381-2387, 2003.
5. Kurebayashi, N., Takeshima, H. , Nishi, M., Murayama, T., Suzuki, E. & Ogawa, Y. Changes in
Ca2+ handling in MG29-deficient skeletal muscle. Biochem. Biophys. Res. Commun. 310, 1266-1272,
2003.
○6. Nishi, M., Sakagami, H., Komazaki, S., Kondo, H. & Takeshima, H. Coexpression of
junctophilin type 3 and type 4 in brain. Mol. Brain Res. 110, 102-110, 2003.
7. Lutfy, K., Eitan, S., Bryant, C. D., Yang, Y. C., Saliminejad, N., Walwyn, W., Kieffer, B. L.,
Takeshima, H. , Carroll, F. I., Maidment, N. T. & Evans, C. J. Buprenorphine-induced
antinociception is mediated by mu-opioid receptors and compromised by concomitant activation of
opioid receptor-like receptors. J. Neurosci. 23, 10331-10337, 2003.
8. Koizumi, M., Midorikawa, N., Takeshima, H. & Murphy, N. P. Exogenous, but not endogenous
nociceptin modulates mesolimbic dopamine release in mice. J. Neurochem. 89, 257-263, 2004.
9. Uezu, K., Sei, H., Sano, A., Toida, K., Suzuki-Yamamoto, T., Houtani, T., Sugimoto, T., Takeshima,
H. , Ishimura, K. & Morita, Y. Lack of nociceptin receptor alters body temperature during the resting
period in mice. Neuroreport 15, 751-755, 2004.
10. Pan, Z., Hirata, Y., Nagaraj, R. Y., Zhao, J., Nishi, M., Hayek, S. M., Bhat, M. B., Takeshima, H.
& Ma, J. Co-expression of mg29 and ryanodine receptor leads to apoptotic cell death-effect mediated
by intracellular Ca2+ release. J. Biol. Chem. 279, 19387-19390, 2004.
11. Sakakibara, T., Nemoto, Y., Nukiwa, T. & Takeshima, H. Identification and characterization of a
novel Rho GTPase activating protein implicated in receptor-mediated endocytosis. FEBS Lett. 566,
294-300, 2004.
12. Andoh, T. , Yageta, Y. , Takeshima, H. & Kuraishi, Y. Intradermal nociceptin elicits
itch-associated responses through leukotriene B4 in mice. J. Invest. Dermatol. 123, 196-201, 2004.
13. Minamisawa, S., Oshikawa, J., Takeshima, H. , Hoshijima, M., Wang, Y., Chien, K. R., Ishikawa,
Y. & Matsuoka, R. Junctophilin type 2 is associated with caveolin-3 and is down-regulated in the
hypertrophic and dilated cardiomyopathies. Biochem. Biophys. Res. Commun. 325, 852-856, 2004.
14. Brotto, M. A., Nagaraj, R. Y., Brotto, L. S., Takeshima, H. , Ma, J. & Nosek, T. M. Defective
maintenance of intracellular Ca2+ homeostasis is linked to increased muscle fatigability in the
MG29 null mice. Cell Res. 14, 373-378, 2004.
15. Okabe, C., Takeshima, H. & Murphy, N. P. Methamphetamine sensitization in nociceptin
receptor knockout mice: locomotor and c-fos expression. Eur. J. Pharmacol. 507, 57-67, 2005.
○16. Yoshida, M., Minamisawa, S., Komazaki, S., Shimura, M., Kume, H., Zhang, M., Matsumura,
K., Nishi, M., Saito, M., Ishikawa, Y., Yanagisawa, T. & Takeshima, H. Impaired Ca2+ store functions
in skeletal and cardiac muscle cells from sarcalumenin-deficient mice. J. Biol. Chem. 280,
3500-3506, 2005.
17. Taverna, F. A., Georgiou, J., McDonald, R. J., Hong, N. S., Kraev, A., Salter, M. W., Takeshima,
H. , Muller, R. U. & Roder, J. C. Defective place cell activity in nociceptin receptor knockout mice
with elevated NMDA receptor-dependent long-term potentiation. J. Physiol. in press.


Ｓ中間－4-2
英文総説：
1. Takeshima, H. Intracellular Ca store in embryonic cardiac myocytes.
2+
Front. Biosci.7,
d1642-1652, 2003.
○2. Takeshima, H. Knockout mice lacking ryanodine receptor and junctophilin subtypes.
Ryanodine receptors (Chapter 14, pp.141-150), Wehrens, X. H. T. & Marks, A. R., Springer, 2
004.
国際学会招待口演：
1. Takeshima, H. , "Junctophilins and muscle E-C coupling", Gordon Research Conference; Muscle
Excitation-Contraction Coupling (Jun 11, 2003 in New London, USA.).
2. Takeshima, H. , "Junctional membrane complexes and muscle E-C coupling", European Muscle
Conference (Sep 20, 2004 in Elba Island).

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